蛋白样品的制备是WB实验的第一步，也是非常关键的一步，做好WB的前提是提取出质量好的蛋白质，这样才能跑出美观又可靠的条带。不同样本提取蛋白的方法不同——譬如血液、消化液和分泌液等体液中的可溶性蛋白质可不经抽提直接分离；而胞内蛋白的抽提则需先将细胞膜或细胞壁破碎后用适当溶剂将蛋白质溶出，再用离心法除去不溶物得到抽提液。下图简单概括了严格意义上动物蛋白抽提的步骤：

蛋白质的提取（冰上防止蛋白裂解）：

1. 单层贴壁细胞

(资料图片)

（i）吸去培养皿中培养液，加入预冷PBS缓冲液洗3次；

（ii）将适量裂解液（RIPA+蛋白酶抑制剂+磷酸酶抑制剂+PMSF）均匀加入培养皿表面；

（iii）冰上裂解适当时间后将裂解的细胞用细胞刮棒刮下，然后用移液枪将细胞碎片和裂解液转移入离心管内（刮完马上转移），并反复吹打充分破碎细胞（吹打过程需避免反复打入气泡；若实验条件允许可用超声细胞破碎仪替代吹打）；

（iv）4℃离心取上清即为总蛋白。

2. 加药物处理的贴壁细胞

由于受药物影响，一些细胞脱落下来，故除按单层贴壁细胞操作外还应收集培养液中的细胞。

（i）将培养液移入离心管内离心适宜时间；

（ii）弃去上清后加PBS缓冲液吹打洗涤并离心，弃上清后用PBS再次洗涤；

（iii）用移液枪将上清充分吸去后加入裂解液并于冰上裂解适宜时间（裂解同单层贴壁细胞处理）；

（iv）将裂解液与培养瓶中裂解液混合，于4℃离心后取上清即为总蛋白。

3. 组织细胞

（i）取适量组织加入预冷裂解液后将组织尽量剪碎并用组织匀浆器匀浆；

（ii）冰上静置适宜时间（可间隔一段时间重复碾碎组织操作而使组织尽量碎裂）；

（iii）裂解完成后于4℃离心后收集上清即为总蛋白。

蛋白质的定量——BCA法

（i）标准液制备：梯度稀释标准蛋白定量液（可用裂解液或PBS稀释），完成后置于冰上备用；

（ii）BCA工作液制备：将A液和B液摇晃混匀，按照A液：B液=50:1的比例配置BCA工作液并充分混匀（BCA工作液室温下24h内稳定，故需现用现配）；

（iii）加样孵育：在96孔板中加入蛋白样品或标准品后加入BCA工作液（推荐优先加样，再加工作液，以保证反应完全），设置3个复孔，充分混匀，注意尽量避免出现气泡（若出现气泡需除去气泡避免影响测定），适宜温度下孵育一段时间（需参考说明书描述温度和时间）。

（iii）测定：酶标仪在指定波长下测吸光度，绘制标准曲线并计算蛋白浓度。

原理：BCA法基于双缩脲原理，碱性条件下蛋白质中的肽键可将Cu2+还原成Cu+，BCA鳌合Cu+作为显色剂产生蓝紫色并在562nm有吸收峰，单价Cu+与蛋白质呈剂量相关性，故可根据待测蛋白在562nm处的吸光度计算待测蛋白浓度。

WB用蛋白样品的变性：

（i）计算上样所需蛋白样品体积与上样缓冲液（升温至体温更利于取用，其取用体积通常为蛋白样品体积的1/4）体积；

（ii）于各组蛋白上清样品中分别补入相应体积的上样缓冲液并吹匀。

（iii）沸水变性后冷水冷却，重复三次以保证蛋白样品彻底变性（通常现用现煮）。

（iv）变性后蛋白呈蓝色均匀清亮透明液体，可稍离心后-20℃保存备用。

参考：

[1] 知乎-一站式：蛋白提取方法汇总

[2] 知乎-实验方法：组织蛋白提取及浓度测定（Tissue Proteins Extraction）

[3] 知乎-分子生物学实验｜细胞或组织总蛋白提取与浓度测定（BCA法）

[4] 知乎-生物小白的入门必修课——细胞总蛋白的提取

[5] 刘忠民，常晓彤. 临床分子生物学检验技术实验指导[M]. 武汉：华中科学技术大学出版社, 2020.

[6] 叶棋浓.生物实验室系列 现代分子生物学技术与实验技巧[M].北京：化学工业出版社.2015.

[7] 马文丽. 分子生物学实验手册[M]. 北京：人民军医出版社, 2011.

[8] 钟鼎生物-BCA法实验指南